La produzione eterologa del D

Jan 12, 2024

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 8551 (2023) Citare questo articolo

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La tubercolosi (TBC) è la seconda causa di morte per una singola malattia infettiva dietro il COVID-19. Nonostante un secolo di sforzi, l’attuale vaccino contro la tubercolosi non previene efficacemente la tubercolosi polmonare, né promuove l’immunità di gregge, né previene la trasmissione. Pertanto sono necessari approcci alternativi. Cerchiamo di sviluppare una terapia cellulare che produca un antibiotico efficace in risposta all’infezione da tubercolosi. La D-cicloserina (D-CS) è un antibiotico di seconda linea per la tubercolosi che inibisce la sintesi della parete cellulare batterica. Abbiamo determinato che il D-CS è il candidato ottimale per la terapia cellulare anti-TB grazie alla sua efficacia contro la tubercolosi, al percorso biosintetico relativamente breve e alla sua incidenza a bassa resistenza. Il primo passo verso la sintesi del D-CS è catalizzato dalla L-serina-O-acetiltransferasi (DcsE) che converte L-serina e acetil-CoA in O-acetil-L-serina (L-OAS). Per verificare se il percorso D-CS potesse essere una profilassi efficace per la tubercolosi, abbiamo cercato di esprimere DcsE funzionale nelle cellule A549 come modello polmonare umano. Abbiamo osservato l'espressione di DcsE-FLAG-GFP utilizzando la microscopia a fluorescenza. DcsE purificato dalle cellule A549 ha catalizzato la sintesi di L-OAS come osservato mediante HPLC-MS. Pertanto, le cellule umane sintetizzano DcsE funzionale in grado di convertire L-serina e acetil-CoA in L-OAS, dimostrando il primo passo verso la produzione di D-CS nelle cellule umane.

La tubercolosi (TBC) è una malattia infettiva principalmente respiratoria causata dal batterio Mycobacterium tuberculosis (Mtb)1. La tubercolosi rimane una delle principali cause di morte per malattia trasmissibile in tutto il mondo, infettando 10 milioni di persone e uccidendone 1,5 milioni nel 20212. L'attuale Il vaccino Bacillus Calmette-Guérin (BCG) per la tubercolosi ha tassi di protezione variabili per la tubercolosi polmonare che non durano fino all'età adulta e possono portare a effetti avversi (per la revisione vedere rif.3). Altri tentativi di vaccinazione, come il vaccino MVA85A, sono stati sviluppati per integrare il BCG ma hanno fallito negli studi di fase IIIb, pertanto la profilassi della tubercolosi rimane sfuggente4.

Lo sviluppo di una profilassi efficace contro la tubercolosi rappresenta un’importante opportunità per approcci alternativi. La storia di successo della chemioprofilassi e delle terapie geniche emergenti hanno gettato le basi per la possibilità di sviluppare una profilassi genetica che produca un antibiotico nelle cellule umane (chemioprofilassi genetica). L'isoniazide è stata utilizzata come chemioprofilassi che riduce le probabilità di sviluppare la tubercolosi del 40% in 2 o più anni5. Recentemente si è scoperto che le terapie geniche sono efficaci contro il cancro. La terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR-T) modifica geneticamente le cellule T per includere un recettore dell'antigene chimerico. Ciò aiuta le cellule T a colpire le cellule tumorali, in particolare la leucemia linfoblastica acuta e i linfomi a grandi cellule B6. In uno studio clinico che ha arruolato bambini affetti da leucemia linfoblastica acuta di tipo B per i trattamenti CAR T-22, 17 partecipanti su 20 hanno raggiunto almeno un anno di remissione7. Dopo che la terapia CAR-T ha dimostrato che è possibile modificare geneticamente le cellule per colpire le cellule tumorali, sono stati sviluppati numerosi metodi di somministrazione alternativi e terapie cellulari8. Vista l’efficacia della chemioprofilassi e l’emergere della terapia genica, cerchiamo di esplorare la fattibilità di una chemioprofilassi genetica che produca un antibiotico per prevenire la tubercolosi.

Dopo aver valutato tutti gli antibiotici di prima e seconda linea per la tubercolosi, abbiamo selezionato la via biosintetica della D-cicloserina (D-CS) come candidato ottimale per la chemioprofilassi genetica. In questo studio, ci siamo concentrati sul primo enzima nella via biosintetica, la L-serina-O-acetiltransferasi (DcsE), che produce O-acetil-L-serina (L-OAS) da L-serina e acetil-CoA9 (Fig .1). Abbiamo cercato di verificare se la DcsE funzionale potesse essere espressa nelle cellule A549, un modello di cellule polmonari umane di tipo II10. Abbiamo trasfettato DcsE taggato con FLAG e Green Fluorescent Protein (GFP) in cellule A549 e osservato una produzione di alto livello di DcsE-FLAG-GFP utilizzando la microscopia a fluorescenza. Abbiamo osservato la sintesi in vitro di L-OAS specificamente mediante DcsE purificato utilizzando HPLC-MS. Forniamo prove che il DcsE funzionale può essere sintetizzato nelle cellule umane come primo passo per la sintesi profilattica del D-CS.