Utilizzando Monolite

Jun 14, 2023

Figura 1:Cromatogramma ottenuto dall'analisi di una reazione IVT utilizzando una colonna cromatografica monolitica CIMac PrimaS.

La trascrizione in vitro (IVT) è un passaggio fondamentale nella produzione di RNA messaggero (mRNA). In un webinar del marzo 2022, Rok Sekirnik (responsabile dello sviluppo del processo per le applicazioni di mRNA e DNA plasmidico (pDNA) presso BIA Separations, parte di Sartorius) ha spiegato che l'ottimizzazione delle concentrazioni di reagenti utilizzati durante l'IVT aiuta a massimizzare la quantità di mRNA prodotta. Gli sviluppatori di farmaci hanno un grande bisogno di metodi analitici in grado di misurare l’IVT in tempo reale. Sekirnik ha mostrato come le colonne per cromatografia monolitica CIMac PrimaS consentano l'analisi in linea dell'IVT, compreso il monitoraggio della concentrazione di nucleosidi trifosfati (NTP), reagenti di tappatura e plasmidi.

La presentazione Sekirnik ha osservato che una molecola di mRNA da 4.000 nucleotidi come quella presente nei vaccini mRNA contro SARS-CoV-2 è ~ 1,3 MDa – circa 10 volte più grande di un anticorpo IgG standard. Anche l'RNA messaggero trasporta una carica negativa e diventa idrofobo se esposto ad elevate concentrazioni di sale. Per consentire la traduzione delle proteine, deve avere un cappuccio da 5 ′ e una coda poliadenilata (poli-A). Le code Poly-A possono essere codificate nel modello di DNA utilizzato per la trascrizione o aggiunte enzimaticamente dopo l'IVT. Allo stesso modo, è possibile aggiungere tappi da 5′ durante o dopo l'IVT.

Considerando tali proprietà, gli sviluppatori di farmaci necessitano di metodi analitici in grado di misurare la resa di mRNA e l’efficienza del capping in tempo reale. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è utile per tali valutazioni, ma gli analisti devono selezionare un mezzo di separazione che fornisca una chimica di legame adeguata, un'area superficiale sufficientemente ampia per l'mRNA e capacità di analisi rapide. Nei mezzi a base di sfere contenenti particelle porose, la diffusione limita il trasferimento di massa, richiedendo lunghi tempi di analisi e limitando il potenziale per la valutazione in linea. Le sfere generano anche un flusso controcorrente, producendo uno stress di taglio che diminuisce il recupero.

Le colonne monolitiche CIMac PrimaS si basano sul trasporto di massa convettivo attraverso una fase stazionaria in polimetacrilato. La separazione si basa sulle interazioni multimodali di scambio anionico e di legami idrogeno. Il flusso laminare attraverso la colonna riduce al minimo lo stress di taglio. Rispetto alle particelle porose, i microcanali forniscono una superficie molto maggiore per il legame dell'mRNA. Poiché i canali non hanno pori senza uscita, la loro capacità legante e la loro risoluzione rimangono le stesse a seconda delle velocità di flusso.

Questa funzionalità consente agli analisti di elaborare i campioni abbastanza rapidamente da valutare l'IVT in tempo reale senza diminuire la risoluzione. Sekirnik ha osservato che un test può separare e quantificare mRNA, pDNA, reagenti di tappatura e NTP distinti (Figura 1). I risultati vengono generati in meno di tre minuti.

Tali funzionalità consentono il monitoraggio e il controllo della cinetica di produzione dell'mRNA, inclusa l'efficienza del capping 5'. Sekirnik ha spiegato che se viene utilizzata un'esonucleasi che degrada selettivamente l'mRNA non coperto, allora un campione può essere analizzato per la concentrazione di mRNA, trattato enzimaticamente e analizzato nuovamente per quantificare le molecole non digerite. Il confronto dei valori di concentrazione prima e dopo il trattamento rivelerà l'efficienza di tappatura di una reazione IVT. Gli analisti possono regolare di conseguenza i regimi di alimentazione e le concentrazioni dei reagenti per ottimizzare la copertura e la resa dell'mRNA.

Sekirnik ha dimostrato questa possibilità utilizzando i dati di un processo IVT in batch. Sartorius ha avviato l'IVT con un rapporto 1:4 tra guanosina trifosfato (GTP) e analogo del cappuccio antireverse (ARCA). Dopo un’ora dall’inizio del processo, l’efficienza di tappatura era elevata (80%), ma la resa era bassa. Il team ha quindi utilizzato una strategia di alimentazione per regolare i livelli di NTP durante tutta la reazione mantenendo il rapporto GTP:ARCA. Tali modifiche hanno aumentato la resa di sei volte (fino a 11,7 mg/ml) senza diminuire l’efficienza di tappatura (80%) o la qualità del prodotto.

Utilizzando un flusso di lavoro di questo tipo, gli analisti possono ottenere rapidamente informazioni sia sull'efficienza del capping che sulla resa. Il software Sartorius PATfix include sequenze analitiche precaricate e strumenti per facilitare il monitoraggio del processo. L'azienda offre anche colonne monolitiche con altre sostanze chimiche leganti per fornire molteplici strumenti per la produzione di mRNA e l'analisi dei processi.