Un metodo per l'etichettatura parallela delle proteine ​​su microscala e un controllo preciso sul grado medio di etichettatura (aDoL)

Dec 02, 2023

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 8961 (2023) Citare questo articolo

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Un approccio ampiamente utilizzato per la coniugazione delle proteine ​​avviene attraverso la reazione dei residui di lisina con NHS o altri esteri attivi. Tuttavia, è difficile controllare con precisione il grado di etichettatura (DoL) a causa dell'instabilità dell'estere attivo e della variabilità dell'efficienza della reazione. Qui forniamo un protocollo per un migliore controllo di aDoL utilizzando i reagenti Click Chemistry esistenti senza rame. È una reazione in due fasi con una purificazione intermedia. In breve, le proteine ​​di interesse sono state prima attivate con azide-NHS. Dopo aver rimosso l'azide-NHS non reagito, la proteina-N3 viene quindi fatta reagire con una quantità limitata di click tag complementare. I nostri studi hanno dimostrato che il click tag reagisce completamente con la proteina N3 dopo 24 ore di incubazione e pertanto non richiede ulteriori passaggi di purificazione. Pertanto, l'aDoL è uguale al rapporto molare di input del clicktag e della proteina. Inoltre, questo approccio offre un modo molto più semplice ed economico per eseguire l'etichettatura parallela su microscala. Una volta che una proteina è stata preattivata con N3-NHS, qualsiasi fluoroforo o molecola con il click tag complementare può essere attaccato alla proteina mescolando i due ingredienti. Le quantità della proteina utilizzata nella reazione click possono corrispondere a qualsiasi quantità desiderata. In un esempio, abbiamo etichettato un anticorpo in parallelo con 9 diversi fluorofori utilizzando un totale di 0,5 mg di anticorpo. In un altro esempio, abbiamo etichettato Ab con un valore aDoL mirato compreso tra 2 e 8. In uno studio di confronto sulla stabilità, abbiamo scoperto che il fluoroforo coniugato utilizzando il protocollo click suggerito è rimasto attaccato alla proteina più a lungo rispetto all'etichettatura standard con fluoroforo NHS.

Le proteine ​​svolgono un ruolo centrale in biologia e renderle visibili o rilevabili è essenziale affinché i ricercatori possano studiarne le funzioni e le interazioni. Nel 2001, Sharpless ha pubblicato un articolo fondamentale che descrive una semplice strategia per accoppiare due molecole insieme tramite un "clic"1. Successivamente, Meldal e Bertozzi svilupparono ulteriormente la chimica e la resero disponibile per un'ampia applicazione2,3, per la quale 20 anni dopo i loro lavori furono riconosciuti e premiati con il Premio Nobel per la chimica. La chimica bioortogonale, o click chemistry, ha dimostrato grandi vantaggi nel mirare, con elevata specificità, singole proteine ​​modificate con sonde o tag in sistemi complessi4,5,6,7,8,9,10. Sono stati inoltre compiuti altri progressi significativi nei metodi di marcatura chemio e regioselettiva per ottenere un unico tag attaccato alle proteine ​​native11,12. Per revisioni complete e libri sulla bioconiugazione delle proteine, consultare13,14,15. Vale anche la pena ricordare che il residuo di cisteina è un altro bersaglio popolare per la coniugazione proteica sito-specifica. La maggior parte delle proteine ​​non contiene tioli liberi nativi che possono essere presi di mira e la riduzione dei legami disolfuro può avere effetti deleteri sulla struttura, quindi l'introduzione di un singolo residuo di cisteina tramite mutazione puntiforme è un approccio preferito per avere un singolo tag attaccato a una posizione precisa della proteina . Indipendentemente dagli approcci sopra menzionati, il classico estere N-idrossisuccinimmide (NHS) e altri esteri attivi rimangono il gruppo funzionale preferito per collegare fluoroforo, cromoforo, biotina e DNA a una proteina tramite residuo di lisina16,17. L'abbondanza di residui di lisina nella maggior parte delle proteine ​​facilita l'etichettatura ed è una reazione in un'unica fase più purificazione in un'unica fase. Tuttavia, a causa dell'instabilità (idrolisi) dell'estere attivo, dell'incoerenza dell'efficienza della reazione e dei problemi di etichettatura eccessiva che incidono sulla funzione della proteina18, rimane un compito arduo.

Qui descriviamo un metodo di etichettatura che garantisce un aDoL mirato utilizzando reagenti chimici a clic privi di rame facilmente disponibili. I siti di attacco sono mirati stocasticamente ai residui di lisina sulla superficie della proteina e l'aDoL è il numero medio di tag (fluorofori) coniugati a ciascuna proteina. È una reazione in due fasi con una fase di purificazione intermedia (mostrata in Fig. 1). Come primo passaggio, la proteina è stata attivata con N3-NHS e l'eccesso di N3-NHS è stato rimosso dopo la reazione. Nella seconda fase, la proteina-N3 è stata miscelata con il fluoroforo-DBCO in un rapporto molare equivalente all'aDoL desiderato. Dopo un'incubazione di 24 ore, la proteina marcata è pronta per l'uso.