Trasformazione delle foglie per un'integrazione casuale efficiente e una modifica mirata del genoma nel mais e nel sorgo

Nov 12, 2023

Nature Plants volume 9, pagine 255–270 (2023) Citare questo articolo

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La trasformazione nelle specie erbacee si è tradizionalmente basata su embrioni immaturi ed è stata quindi limitata ad alcune importanti colture di Poaceae. Sono stati esplorati altri espianti di trasformazione, compreso il tessuto fogliare, ma con bassi tassi di successo, che è uno dei principali fattori che ostacolano l’ampia applicazione dell’editing genomico per il miglioramento delle colture. Recentemente, la trasformazione delle foglie utilizzando i geni morfogenici Wuschel2 (Wus2) e Babyboom (Bbm) è stata utilizzata con successo per la mutagenesi mediata da Cas9, ma le complesse applicazioni di modifica del genoma, che richiedono lo screening di un gran numero di piante rigenerate, rimangono sfuggenti. Qui dimostriamo che una maggiore espressione di Wus2/Bbm migliora sostanzialmente la trasformazione delle foglie nel mais e nel sorgo, consentendo il recupero di piante con abbandoni genici mediati da Cas9 e inserimento genico mirato. Inoltre, utilizzando un costrutto Wus2/Bbm ottimizzato per il mais, sono stati prodotti con successo calli embriogenici e piantine rigenerate in otto specie appartenenti a quattro sottofamiglie di erbe, suggerendo che ciò potrebbe portare a un metodo universale a livello familiare per la trasformazione e la modifica del genoma nelle Poaceae.

La trasformazione genetica e la rigenerazione delle piante con nuovi fenotipi hanno rappresentato una svolta nelle prime biotecnologie vegetali e hanno generato grandi aspettative tra gli scienziati vegetali. Tuttavia, subito dopo la prima segnalazione di una trasformazione riuscita della Nicotiana tabacum utilizzando l’infezione da Agrobacterium1, è diventato evidente che il tabacco rappresenta un’eccezione e che lo sfruttamento del potenziale di questa tecnologia nelle colture principali sarebbe stato impedito da una scarsa trasformazione e/o rigenerazione2. Miglioramenti graduali nella trasformazione sono continuati per varie specie vegetali, ma per molte di esse questo processo è stato limitato dalla recalcitranza alla manipolazione in vitro. Trovare la migliore combinazione di metodo di trasformazione e sistema di coltura per ciascuna coltura ha richiesto la valutazione di diversi espianti che vanno da singole cellule come protoplasti; ai tessuti embrionali come meristema, scutello o cotiledoni; ai tessuti derivati ​​dalle plantule come i meristemi apicali/ascellari, l'ipocotilo o le foglie; e infine alle alternative in planta.

Il recente sviluppo di tecnologie di modifica del genoma basate sulle nucleasi CRISPR (brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate) –Cas (associate a CRISPR) aggrava ulteriormente la necessità di processi di trasformazione migliorati ed efficienti3. Le nucleasi Cas guidate dall'RNA generano rotture mirate a doppio filamento nel genoma, che vengono riparate attraverso percorsi di unione delle estremità non omologhe (NHEJ) o di riparazione diretta dall'omologia (HDR). NHEJ è soggetto a riparazioni imperfette e spesso provoca piccole inserzioni o delezioni, mentre l'HDR può essere utilizzato per introdurre modifiche predefinite fornendo un modello di DNA del donatore con regioni di omologia rispetto al sito di rottura del doppio filamento.

Dai primi rapporti sull’editing del genoma mediato da Cas9 nel tabacco, nell’Arabidopsis e nel riso, l’elenco delle specie vegetali modificate ha continuato ad espandersi4,5,6,7. Tuttavia, mentre la mutagenesi mediata da NHEJ e le eliminazioni geniche sono ormai una pratica comune, altri tipi di modifiche del genoma (come inserimenti genici mediati da HDR, delezioni su larga scala, inversioni e traslocazioni) si verificano con frequenze molto più basse, richiedendo un numero elevato di piante da rigenerare e vagliare per trovarne uno con la modifica desiderata. Questa limitazione è vera per la maggior parte delle specie delle Poaceae (ad esempio riso indica, mais, grano, orzo, sorgo e miglio perlato), dove i metodi di trasformazione si basano su embrioni immaturi e in generale rimangono molto dipendenti dalla specie e/o dal genotipo, limitandone la diffusione su larga scala. Inoltre, una fornitura costante tutto l’anno di embrioni immaturi come espianto di trasformazione richiede infrastrutture di serra che le rendano proibitive in termini di risorse e costi per la maggior parte delle istituzioni accademiche. Di conseguenza, le strutture per i servizi di trasformazione sono diventate una necessità8. Processi di trasformazione migliorati con alte frequenze di rigenerazione diventano quindi un prerequisito per queste complesse applicazioni di modifica del genoma9.